หูชั้นกลางของสัตว์สี่ขา มีต้นกำเนิดเดียวกันกับช่องหายใจ/รูเปิด (spiracle) ของปลา โดยเป็นช่องเปิดจากคอหอย (pharynx) ไปด้านข้างศีรษะที่หน้าช่องเหงือกหลักในตัวอ่อนปลา ช่องจะกำเนิดเป็นช่องกระเป๋าในคอยหอย แล้วเจริญออกมาทะลุกับผิวกลายเป็นช่องหายใจในสัตว์สี่ขาโดยมาก การทะลุจะไม่สมบูรณ์ และเยื่อส่วนเหลือสุดท้ายที่กั้นมันจากโลกข้างนอกก็คือแก้วหูส่วนด้านในของรูเปิดซึ่งยังเชื่อมกับคอหอยอยู่ ก็จะกลายเป็นท่อยูสเตเชียน[3]

ในสัตว์เลื้อยคลาน สัตว์ปีก และซากบรรพบุรุษสัตว์สี่ขาในยุคต้น ๆ มีกระดูกหูเพียงแค่ชิ้นเดียวที่เรียกว่า columella (ซึ่งมีต้นกำเนิดเดียวกับกระดูกโกลนในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม)ซึ่งเชื่อมโดยอ้อมกับแก้วหูผ่านกระดูกอ่อน extracolumella และเชื่อมกับหูด้านในผ่านที่เหยียบ (footplate) ที่ใหญ่ขึ้นผ่านช่องรูปไข่[3]columella เป็นกระดูกอนุพันธ์ของกระดูกที่เรียกว่า hyomandibula ในบรรพบุรุษที่เป็นปลา ซึ่งช่วยค้ำจุนกะโหลกศีรษะและกระดูกหุ้มสมอง

ส่วนโครงสร้างหูชั้นกลางของสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกที่ยังคงอยู่จะต่างกันมาก และบ่อยครั้งจะเสื่อมหน้าที่ลงกบและคางคกโดยมากจะมีหูชั้นกลางเหมือนกับสัตว์เลื้อยคลาน แต่สัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกชนิดอื่นมักจะไม่มีช่องหูชั้นกลางในกรณีเช่นนี้ กระดูกโกลนก็จะไม่มีด้วย บางพวกไม่มีแก้วหู ดังนั้นกระดูกโกลนก็จะเชื่อมกับกระดูก quadrate bone ที่กะโหลกศีรษะ ซึ่งเชื่อว่ายังสามารถส่งแรงสั่นไปยังหูชั้นในในสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกจำนวนมาก ยังมีกระดูกหูที่สองเรียกว่า operculum (โดยไม่ควรสับสนกับกระดูกปลาที่มีชื่อเดียวกัน)นี่เป็นกระดูกแบนคล้ายจาน ที่อยู่ทับช่องรูปไข่ โดยเชื่อมกับกระดูกโกลน หรือเชื่อมผ่านกล้ามเนื้อพิเศษกับส่วนที่เรียกว่า scapulaซึ่งไม่พบในสัตว์มีกระดูกสันหลังอื่น ๆ[3]

สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมีหูชั้นกลางพิเศษคือมีกระดูกหู 3 ท่อน แตกต่างจากกระดูกท่อนเดียวของสัตว์มีกระดูกสันหลังบนบกอื่น ๆ โดยวิวัฒนาการขึ้นทั้งหมดในยุคไทรแอสซิกโดยหน้าที่แล้ว หูชั้นกลางของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเหมือนกับของสัตว์อื่น ๆ ยกเว้นว่า มันสามารถตอบสนองต่อเสียงความถี่สูงดีกว่า เพราะหูชั้นในสามารถได้ยินความถี่เสียงสูงกว่าสัตว์อื่น ๆ

กระดูกค้อนวิวัฒนาการมาจากกระดูก articular ของขากรรไกรล่าง และกระดูกทั่งจาก quadrateในสัตว์มีกระดูกสันหลังอื่น ๆ กระดูกสองชิ้นนี้เป็นกระดูกข้อต่อหลักที่ขากรรไกร โดยในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม กระดูกชิ้นที่เรียกว่า mandible (ขากรรไกรล่าง) ได้ขยายใหญ่ขึ้นเป็นข้อต่อแทน ทำให้ข้อต่อเก่ากลายเป็นส่วนของหูได้ในช่วงเวลาหนึ่ง กระดูกขากรรไกรทั้งสองแบบได้อยู่ด้วยกัน โดยอันหนึ่งอยู่ด้านใน (medial) และอันหนึ่งอยู่ด้านข้าง (lateral)ดังนั้น กระบวนการวิวัฒนาการที่นำไปสู่หูชั้นในมีกระดูก 3 ชิ้น จึงเป็นผลข้างเคียง "โดยบังเอิญ" ของวิวัฒนาการกระดูกขากรรไกรที่สองใหม่

ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจำนวนมาก หูชั้นในยังได้รับการปกป้องในช่องกระดูกที่เรียกว่า auditory bulla ซึ่งสัตว์มีกระดูกสันหลังอื่นไม่มีช่องกระดูกนี้ วิวัฒนาการขึ้นภายหลังและเกิดขึ้นต่างหาก ๆ หลายครั้งหลายคราวใน clade ต่าง ๆ ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เป็นช่องที่อาจล้อมด้วยเยื่อ กระดูกอ่อน หรือกระดูกเช่น ในมนุษย์ ช่องนี้เป็นส่วนของกระดูกขมับ[3]